HPLC法同时测定乳核内消液中4种有效成分

（1.淄博市食品药品检验研究院, 山东 淄博 255086；2.淄博市药物警戒中心, 山东 淄博 255086）

摘   要: 目的：建立高效液相色谱法同时测定乳核内消液中芍药苷、迷迭香酸、甘草苷、甘草酸铵4种有效成分含量的方法。方法：采用色谱柱为Agilent Eclipse Plus C18 （5μm；4.6×250mm），流动相为乙腈-0.1%磷酸（梯度洗脱），流速为2.0ml/min，检测波长分别为237nm，330nm。结果：芍药苷、迷迭香酸、甘草苷和甘草酸铵线性范围分别0.241～4.82μg，0.0239～0.599μg，0.0532～1.331μg和0.0396～0.792μg；回收率分别为99.84%、102.67%、98.97%和99.65%，RSD均小于2.0%；测定了3批样品中芍药苷、迷迭香酸、甘草苷和甘草酸铵的含量。结论：本方法操作简单、快捷、灵敏度高，可用于乳核内消液中4种成分的检测。

关键词：高效液相色谱法；乳核内消液；含量测定

乳核内消液是纯中药制剂，处方源于唐代孙思邈的《千金要方》，是由当归、赤芍、甘草、夏枯草等十二味中药经过煎煮、过滤、浓缩等工艺精制而成，该方从调肝入手，具有疏肝活血、软坚散结之功效，在临床应用中，除能有效治疗经期乳房胀痛，月经不调及乳腺增生以外[1]，还对痛经和黄褐斑有明显效果。夏枯草为方中的重要味药，具有清热泻火，明目，散结消肿的功效。迷迭香酸是其重要的活性成分[4]。甘草在方中有调和作用，同时具有补中益气、泻火解毒的作用，甘草苷为其中重要的特征性成分[5]。现收载于《卫生部药品标准中药成方制剂》第六册。现行质量标准中无含量测定项，无法有效控制产品质量，因此，急需建立准确、简单、高效的多组分同时测定的方法。根据现有文献，有对乳核内消液中芍药苷和阿魏酸进行含量测定的报道[2,3]，其他药材有效成分的含量测定尚未见报端。本文采用HPLC法同时对3味药材的4种特征成分（芍药苷、迷迭香酸、甘草苷、甘草酸铵）进行含量测定。方法简单准确、灵敏度高，可以为乳核内消液的质量控制提供重要参考。

1 仪器与试药

1.1 仪器

Agilent 1260高效液相色谱仪，DAD检测器（美国安捷伦公司）；十万分之一MS205DU电子分析天平（瑞士梅特勒-托利多公司）；KQ-300GVDV型超声波清洗器（宁波科生仪器厂）。

1.2试药

对照品芍药苷（批号：110736-202145，含量：94.6%），迷迭香酸（批号：111871-202007，含量：98.1%），甘草苷（批号：111610-201908，含量：95.0%），甘草酸铵（批号：110731-202021 含量；96.2%）均购自中国食品药品检定研究院；乳核内消液（批号：19261913，19261521，20260600）均为市售；甲醇，乙腈为色谱纯。

2 方法与结果

2.1 溶液的制备

2.1.1对照品溶液的制备  

精密称取芍药苷对照品10.18mg、迷迭香酸对照品11.97mg、甘草苷10.64mg和甘草酸铵9.89mg，加50%甲醇制成每1ml含芍药苷254.5μg、迷迭香酸23.94μg、甘草苷53.20μg和甘草酸铵39.56μg的混合对照溶液。

2.1.2供试品溶液的制备  

取本品适量，混匀，精密量取5ml，置25ml量瓶中，加50%甲醇适量，超声处理20分钟，取出，放冷，加50%甲醇至刻度，摇匀，滤过，取续滤液，即得。

2.1.3阴性样品溶液的制备  

按工艺方法制备缺赤芍、夏枯草、甘草的阴性样品，按2.1.2项下供试品溶液制备方法，制备阴性样品溶液。

2.2色谱条件  

色谱柱：Agilent Eclipse Plus C18 （5μm；4.6×250mm）；检测器：DAD检测器；检测波长：330nm（迷迭香酸）、237nm（芍药苷，甘草苷和甘草酸铵）；流动相：乙腈（A）-0.1%磷酸溶液（B）；梯度洗脱（流动相A 0→2min，8%；2→10min, 8%→25%；10→30min，25%→90%）；流速：2.0ml/min；柱温：35℃；进样量：10μl。在此色谱条件下，色谱峰的理论板数均大于5000，相邻峰的分离度大于1.5，阴性样品无干扰。色谱图见图1。

A．混合对照品（237nm）B.混合对照品（330nm）C.供试品（237nm）D.缺芍药苷、夏枯草和甘草阴性样品（237nm）E.空白溶剂 1.芍药苷 2.甘草苷 3.迷迭香酸 4.甘草酸铵

图 1  HPLC色谱图

2.3  线性关系考察  

精密吸取对照品溶液1、5、10、15、20、25μl，注入液相色谱仪，测定峰面积。以进样量（μg）为横坐标，峰面积为纵坐标，绘制标准曲线。结果，芍药苷进样量在0.241～4.82μg范围内，Y=763.7X-667.1（r=0.9999）；迷迭香酸在0.0239～0.599μg范围内， Y=174X-150.6（r=0.9998），甘草苷在0.0532～1.331μg范围内，Y=254.9X-223.2（r= 0.9998），甘草酸铵在0.0396～0.792μg范围内，Y=53.37X-45.99（r=0.9998），线性关系良好。

2.4 精密度试验  

精密吸取上述混合对照品溶液10μl，按“2.2”项下色谱条件重复进样6次，芍药苷、迷迭香酸、甘草苷、甘草酸铵峰面积的RSD分别为0.78%、0.91%、1.1%和0.95%（n = 6），表明仪器的精密度良好。

2.5  重复性试验  

取同一批号乳核内消液样品（批号：19261913）6份，按“2.1.2”项下的方法制备，按“2.2”项下色谱条件进样10μl，分别测定芍药苷、迷迭香酸、甘草苷和甘草酸铵，结果平均含量分别为1.09、0.14、0.05和0.19mg/ml ，RSD分别为1.0%、1.4%、1.6%和1.5%，表明方法重复性良好。

2.6 稳定性试验

取供试品溶液（批号：19261913）分别于在0、2、4、8、12、24h分别进样10μl，结果芍药苷、迷迭香酸、甘草苷和甘草酸铵峰面积的RSD分别为1.0%、1.5%、1.8%和1.3%，表明供试品溶液在24h内稳定。

2.7回收率试验  

精密量取同一批样品（批号：19261913）2.5ml，置25ml量瓶中，共9份，分别精密加入混合对照品溶液（浓度分别为1256、185、65和241μg/ml）1ml、2ml、3ml，按“2.1.2”项下的方法制备，分别进样10μl分析，计算加样回收率，结果芍药苷、迷迭香酸、甘草苷和甘草酸铵平均回收率分别为99.84%、102.67、98.97%和99.65%，RSD分别为1.20%、1.51%、1.35%和1.67%。

2.8  样品检测结果

取不同批号的乳核内消液，按“2.1.2”项下的方法制备，按“2.2”项下色谱条件，分别测定芍药苷、迷迭香酸、甘草苷和甘草酸铵，结果见表1。

表1 样品含量测定结果（mg/ml）

3 讨论

3.1  检测波长的选择

采用DAD检测器在200～400nm之间进行全波长扫描，根据4种成分紫外最大吸收波长以及各组分的含量，并查阅相关文献[4-8]，选择237nm波长处测定芍药苷、甘草苷和甘草酸铵，采用330nm波长处测定迷迭香酸的含量。多波长同时测定可以大大提高检测灵敏度，提高工作效率，同时减少测量误差。

3.2 流动相的选择

考察了甲醇-水和乙腈-水系统，结果色谱峰拖尾，分离度不理想，以乙腈-0.1%磷酸为流动相，峰形尖锐，分离度均大于1.5。采用等度洗脱很难将4种成分与其他复杂成分分离开，因此建立一种梯度洗脱方法[9-12]，色谱峰分离度好，灵敏度高，稳定性和精密度都较理想。

3.3 小结

  本文建立HPLC法同时测定乳核内消液中4中成分的定量分析方法，该方法专属性强，重现性好，可为乳核内消液的综合评价提供依据。 

 参考文献

[1] 中华人民共和国卫生部药品标准：中药成方制剂第六册[S].1992:91.

[2] 黄安军，聂晓玲.HPLC法同时测定乳核内消液中芍药苷和阿魏酸的含量[J].西北药学杂志，2009,24（6）：436-437.

[3] 房华蓉.HPLC法测定乳核内消液中芍药苷的含量[J].海峡要学，2013,25（10）：61-62.

[4] 中国药典2020年版[S].一部2020：108.

[5] 中国药典2015年版[S].一部2020：88.

[6] 中国药典2015年版[S].一部2020：292.

[7] 魏龙.高效液相色谱法测定加味逍遥丸芍药苷的含量[J].中国医药指南，2013,11（29）：47-48.

[8] 陈帅，王磊，高双等.HPLC-DAD法同时测定加味逍遥丸中8种成分[J].中草药，2016,47（21）：3829-3833.

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[12] 朱月梅，梁茂本，张沂等.HPLC法测定天丹通络片中3种活性成分的含量[J].西北药学杂志，2020,35（2）：213.