电致化学发光法测定血清中多巴胺含量

（赣南医学院药学院，江西 赣州 341000）

摘  要：苝四甲酸（PTCA）纳米棒在过硫酸根（S2O82-）作为共反应试剂的条件下具有高的电致化学发光（ECL）信号，且多巴胺（DA）可以显著猝灭该体系ECL信号。采用PTCA修饰电极，构建用于灵敏检测DA的ECL传感器。随着DA浓度的增加，PTCA/S2O82-体系的ECL信号逐渐降低，并且在DA浓度为 1 nmol/L~ 500 μmol/L范围内，传感器ECL信号和其浓度对数值呈现良好的线性关系，线性方程为I=-2155.18 lgcDA+6819.86，线性相关系数为R=0.9991，检出限为0.3 nmol/L。血清样品中DA的加标回收率为97.5%~105.8%。本工作为血清中DA快速、灵敏测定提供了新的思路。

关键词：多巴胺；电致化学发光；苝四甲酸；血清

基金项目：赣南医学院科研课题项目（YB201905）

第一作者简介：曾卫佳（1994.10-）陕西宝鸡人，赣南医学院，硕士，助教，主要研究方向：电化学发光生物传感器。

引言

多巴胺（DA）是一种儿茶酚胺类神经递质，其参与调控中枢神经系统的多种生理功能。据相关研究报道，体内DA水平异常通常和帕金森病、精神分裂症、垂体肿瘤和注意力缺陷多动综合症等疾病的发生有关。此外，在临床上，DA含量水平也常作为嗜铬细胞瘤、高儿茶酚胺血症、帕金森病、抑郁症、药物成瘾等疾病诊断的依据。因此，实现对DA的快速灵敏测定具有十分重要的意义。目前常见的测定DA的方法主要有高效液相色谱法、电化学方法等[3]，其中，电致化学发光（ECL）技术由于其具有较强的可控性、成本低、灵敏度高、检测快速等优点引起了广泛的关注。因此在本工作中，基于DA能够有效猝灭PTCA/S2O82-体系的ECL信号，构建了可灵敏测定DA的ECL生物传感器，实现对DA的灵敏测定，以期建立测定DA的新方法。

1 实验部分

1.1 实验仪器及试剂

MPI-E II型电致化学发光分析系统（西安瑞迈分析仪器公司），S-4800 扫描电子显微镜( SEM，日本日立公司)，苝四甲酸二酐（PTCDA），多巴胺（DA），抗坏血酸（AA），L-半胱氨酸（L-Cys），L-组氨酸（L-His），盐酸（HCl），氢氧化钠（NaOH），过硫酸钾（K2S2O8）等购于国药集团化学试剂有限公司，所有试剂均为分析纯，实验用水均为超纯水。

1.2 苝四甲酸（PTCA）纳米棒制备

称取5 mg PTCDA，并将其加入到5 mL新配制的NaOH溶液中，混合之后加热直到PTCDA完全溶解，溶液颜色变为黄绿色。随后，在上述混合液中逐滴地加入1 mol/L的HCl溶液，直到混合液颜色变为红色。之后，再离心收集红色沉淀，分别用乙醇和超纯水交替洗涤3次。然后收集红色沉淀并置于真空干燥箱中干燥获得PTCA纳米棒，再称取1mg PTCA纳米棒分散于1 mL超纯水中备用。

1.3 苝四甲酸修饰电极制备

首先，依次用0.3μm和0.05μm的Al2O3粉末将玻碳电极（GCE）打磨干净，再用超纯水清洗干净，置于自然条件下晾干。之后，在其表面滴加5 μL PTCA纳米棒分散溶液，自然条件下晾干成膜，制得PTCA修饰电极。

1.4 检测方法

本实验采用三电极体系进行检测，其中PTCA修饰电极作为工作电极，Ag/AgCl作为参比电极，Pt电极作为对电极。用MPI-E II型电致化学发光分析系统检测传感器的ECL信号，详细地，含有S2O82- (100 mmol/L)的PBS(pH=7.4)作为检测底液，分别加入不同浓度DA，并将PTCA修饰电极置于其中检测ECL信号。工作电位为-2~0V，扫速为0.6V/s，光电倍增高压管为800V。 

2 结果与讨论

2.1 PTCA纳米材料的形貌表征

用SEM表征了PTCA纳米材料的微观形貌，结果如图1所示，可以看出PTCA纳米材料呈现出短棒状的结构，其长度约为200 nm左右。所制备的PTCA纳米材料的微观形貌和大小与参考文献相符合[6]，表明PTCA纳米棒被成功合成。

图1 PTCA纳米材料的SEM图

2.2 PTCA纳米棒的ECL行为

在不同条件下探究了PTCA纳米棒在不同溶液中的ECL行为。当PTCA修饰电极在PBS中检测时，可以看到有微弱的ECL响应，响应信号为400 a.u.，这是由PTCA的激发态回到基态时产生的信号。当PTCA修饰电极在含有S2O82-(100 mmol/L)的PBS溶液中检测时，ECL信号明显增强且信号值为13100 a.u.，表明S2O82-作为PTCA的共反应试剂，可显著增强其ECL信号。

2.3 实验条件优化

2.3.1 检测底液浓度优化

分别在含有不同浓度S2O82- (20、40、60、80、100、120 mmol/L)的PBS溶液中检测了PTCA修饰电极的信号，当S2O82-浓度增高时，PTCA修饰电极的ECL信号也逐渐增加，并且在S2O82-浓度为100 mmol/L时到达最大，之后趋于平缓。因此，后续的实验均选择 100 mmol/L作为最佳测试浓度。

2.3.2 底液pH优化

分别在pH=6.0、7.4、9.0的检测底液中测定PTCA修饰电极的ECL信号。结果表明，pH对PTCA修饰电极的ECL信号有一定的影响。当检测底液的pH值为7.4时，PTCA修饰电极的ECL信号最高，且峰形最好，因此，选择pH值为7.4的含S2O82-的PBS缓冲液作为检测底液。

3 血清中DA的测定

3.1 线性方程及检出限

基于DA可以高效猝灭PTCA/S2O82-二元ECL体系的ECL信号，用所制备的传感器（PTCA修饰电极）对DA进行定量分析。以pH=7.4的含有100 mmol/LS2O82-的PBS缓冲液作为检测底液，其他条件为最佳条件下，在检测液中分别加入不同浓度的DA，并将PTCA修饰电极置于其中，并分别记录其ECL信号。结果如图2A所示，在DA浓度为1 nmol/L至500 μmol/L范围内，随着DA浓度逐渐增大，PTCA修饰电极的ECL信号逐渐降低（曲线a到i）。另外，从图2B中可以看出，DA浓度的对数值和PTCA修饰电极的ECL信号呈现出较好的线性关系，且线性回归方程为：I = -2155.18 lgcDA+6819.86，相关系数（R）为0.9991，检测限为0.3 nmol/L。

图2 传感器对不同浓度DA的ECL响应曲线（A）及校准曲线（B）

3.2 稳定性和重现性

在最佳实验条件下，将PTCA修饰电极置于含有DA浓度为500 nmol/L的检测底液中，连续扫描10圈，所测得的ECL信号基本一致，且10圈的ECL信号的相对标准偏差为0.7%，表明该传感器具有较好的稳定性。另外，对传感器的重现性也进行了考察，在相同条件下，用PTCA修饰电极对含有浓度为1 μmol/L DA检测底液平行测定了3次，所测得的ECL信号基本一致，表明该传感器具有较好的重现性。

3.3 干扰实验

为了探究所制备传感器的选择性，本实验选择了几种和DA同时存在且氧化电位接近的生物小分子作为干扰物质，包括抗坏血酸（10 μmol/L）、L-半胱氨酸（10 μmol/L）、L-组氨酸（10 μmol/L）。当将PTCA修饰电极分别置于含上述干扰物质的检测底液中测定时，干扰物质所引起的信号降低值远远小于含有100 nmol/L DA所引起的ECL信号降低值，并且干扰物质的ECL信号和空白信号基本一致，这些结果都表明所制备的传感器具有较高的选择性，能够实现对DA的特异性测定。

3.4. 血清样品中DA的测定

为了评估所制备传感器的实际应用潜力，在最佳条件下，进行了加标回收实验。首先，将人血清样品稀释50倍，然后利用稀释后的人血清样品将高浓度的DA标准溶液配制成不同浓度的样品，并用所制备传感器分别测定其ECL信号，实验结果如表1所示，从表中可以看出，该电极的测定回收率在97.5%~105.8%，表明该传感器可较好地应用于人血清中DA的测定。 

表1 稀释的血清样品中DA的回收率

4 结论

在本工作中，制备了PTCA纳米棒修饰电极，基于DA可以高效猝灭PTCA/S2O82-体系的ECL信号，构建了可灵敏、快速测定DA的传感器，并将所制备的传感器用于血清中DA的测定，实验结果表明所制备的传感器具有灵敏度高、稳定性好、成本低、制备简单等优点，为血清中DA的测定提供了新思路，具有较大的市场应用潜力。

参考文献

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[3] 陈少华, 陈文量, 丁益, 等. 纳米材料及其三维结构修饰电极检测多巴胺的研究进展[J]. 化工进展, 2021,40(11): 6135-6144.

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[6] Song, Xianzhen, Li, Xiaojian, Wei, Dong, et al. CuS as co-reaction accelerator in PTCA-K2S2O8 system for enhancing electrochemiluminescence behavior of PTCA and its application in detection of amyloid-β protein [J]. Biosensors and Bioelectronics, 2019, 126: 222-229.

      来源：化学工程与装备 - 官方网站 - 创刊于1972   2022年第12期   在线投稿  >>